半滑舌鳎脑星形胶质细胞系建立、鉴定及其雌性特异蛋白CSW3的表达与应用研究

【摘要】鱼类细胞培养始于20世纪60年代。自从1962年，世界上第一个鱼类细胞系，虹鳟性腺细胞系—RTG-2被建立以来，已有280多种鱼类细胞系相继被建立，使得鱼类细胞系的建立和研究得到迅速的发展。鱼类细胞系的材料来源广泛，包括体表组织（鳍条，鳃盖膜，吻端等），体内组织（肝脏，肾脏，心脏，脾脏，鳔，性腺等），还有胚胎（囊胚，原肠胚等）。鱼类细胞系的应用使得鱼类病毒学，环境毒理学，免疫学，鱼类生理学，肿瘤学，内分泌学等相关学科得到相应发展。半滑舌鳎作为我国的一种重要的海水养殖鱼类，具有极高的经济价值。而且半滑舌鳎雌雄个体间具有的明显生长差异，及性别逆转现象和ZW型性别决定体系使其在研究鱼类性别调控方面具有极高的科研价值。目前，已在半滑舌鳎中建立鉴定了卵巢，精巢，头肾，肝脏，心脏组织和胚胎细胞系，而与神经组织相关的细胞系尚未见报道。为了更好地开展半滑舌鳎神经相关调控机理与损伤修复等方面的研究，本文通过对半滑舌鳎脑细胞进行分离培养，成功获得星形胶质细胞系，并从蛋白水平，分子水平对该细胞系进行了鉴定，还利用已经建立的星形胶质细胞系进行转基因，染色体核型分析,病毒感染等研究。具体工作内容如下：用组织块法结合酶消化法建立了半滑舌鳎星形胶质细胞系，命名为CSAC。细胞在20%胎牛血清的MEM培养基中生长良好，细胞形态为典型的上皮样，于首次接种后15天铺满瓶底，传代周期为3至5天。细胞可在15oC至24oC温度范围内生长，最适生长温度为24oC。在含有5%至25%浓度血清的培养基中该细胞能够生长，最适生长浓度为20%FBS。对该细胞系进行染色体核型分析表明，CSAC的二倍体核型为2n=42，含有异型W染色体。利用星形胶质细胞特异表达蛋白-神经胶质酸性纤维原蛋白（GFAP）特异抗体对CSAC进行鉴定，并从RNA水平上进一步确认，结果表明该细胞系为星形胶质细胞系。利用脂质体介导的方法对CSAC进行GFP报告基因的转染，结果发现很强的荧光信号，转染效率为30%左右。本文探索了半滑舌鳎星形胶质细胞的培养方法，并对培养细胞进行鉴定，染色体制备，转基因，病毒感染等方面的研究。作为鲆鲽鱼类第一个星形胶质细胞细胞系，CSAC是鲆鲽鱼类神经调控相关研究的理想工具。本文还探索了半滑舌鳎一个雌性特异蛋白CSW3的表达与应用。构建了半滑舌鳎雌性特异基因CSW3重组表达载体，转化大肠杆菌进行基因重组表达，对基因表达产物进行分离纯化，并研究了纯化的蛋白对几个性别决定基因的影响。结果表明雌性特异CSW3蛋白对半滑舌鳎性腺foxl2、sox9a、amh三种性别相关基因表达水平造成影响，能够引起雌性相关基因fox12表达上调，雄性相关基因sox9和amh表达下降。
【作者】王天姿；
【导师】陈松林；
【作者基本信息】中国海洋大学，海洋生物学，2014，硕士
【关键词】半滑舌鳎；脑；星形胶质细胞系；鱼类；CSW3；

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